Illumina测序产生的重复序列

2023-06-21

Illumina的Patterned Flow Cell产生重复序列

QC Fail Sequencing内容

以下内容摘录并翻译自QC Fail Sequencing，完整内容请查看：
Illumina Patterned Flow Cells Generate Duplicated Sequences

介绍

Illumina最近的一项创新是有序的流动槽，它首次应用在HiSeq X，随后也应用于HiSeq 3000和HiSeq 4000测序仪。通过规律化排列数十亿个固定大小的纳米孔，使其在流动槽中均匀分布，能够产生更高密度的DNA簇（可以更有效地利用Flow Cell表面积，增加数据产出，减少成本，降低运行时间）。
虽然有以上这些优点，但有证据表明，与早期设计（Nonpatterned Flow Cell）相比，Patterned Flow Cell会产生更多的重复序列。

症状

使用 HiSeq 4000和HiSeq 2500（用的是Nonpatterned Flow Cell）对同一个Hi-C文库进行测序。测序后，数据使用 HiCUP 分析。
与预期一致，HiSeq 4000产出的原始Reads数是383M，远多于HiSeq 2500的257M。
然而，同一文库的这两次测序之间的重复序列比例存在显着差异。经过去重处理后，HiSeq 2500只有 2% 的原始序列被过滤，这与HiSeq 4000去除了 33% 形成鲜明对比。
duplicates_graph
经过HiCUP流程分析后，用不同测序仪测序的两个样本最后都剩余55M Reads，HiSeq 4000原本增加的数据产出被抵消了。

诊断

在研究两台测序仪之间的差异之前，为了排除这种可能性：即HiSeq 4000测到的重复序列比例增加，仅仅是因为它测到了更多di-tags（一般测序文库里的DNA Fragments），即给定样本被测序的次数越多，测到重复序列的可能性就越高（也就是测序数据量较高，文库复杂度较低时，出现的Dup率高的情况）。为了确认这一点，对HiSeq 4000的FASTQ文件随机抽样，缩小到与 HiSeq 2500相同的Reads数量。然后还是用HiCUP流程分析，这次HiSeq 4000数据中的 25% 在去重步骤中被过滤掉，仍然远远超过HiSeq 2500的 2% 。
为了查证产生重复序列的可能原因，我们分析了流动槽上重复序列的空间分布。对于两台测序仪，重复序列都是均一形式分布，没有呈现出明显的“热点”区域。虽然重复序列没有分布在流动槽的特定区域，但一般来说，重复序列仍然可能与其拷贝有位置相关关系。为了验证这一假设，我们找到重复序列的两个拷贝序列，并记录它们的位置是在1还是2个Tiles上（Illumina数据可以通过Reads ID知道该Read/cluster的坐标，包括Lane、Tile、X、Y，就可以判断两条Reads是否来源于同一个Tile）。值得注意的是，HiSeq 2500的重复序列有 1% 来自同一个Tile，而HiSeq 4000是 92% 。这种重复序列的位置接近性，说明在HiSeq 4000上观察到的重复序列主要是测序仪特有的Sequencing artefacts。
one_two_tile_graph
为了进一步表现这种二维距离，我们提取了只来自1个Tile的重复序列，然后记录了同一重复序列之间的相对位置（还是基于Illumina数据的Reads ID中含有的坐标信息）。下图将这些序列的相对距离展示为密度图（对于每个重复序列，其中一条序列被指定为原点，图中显示了“其他重复序列”与原点的相对位置）。
relative_position_of_duplicates
HiSeq 2500 除了靠近原点的高密度区域外，在整个图上的是均匀分布的。而HiSeq 4000 原点周围的密度升高更为明显，几乎所有其他重复序列都集中在原点区域。我们猜测远离原点的那些重复序列是来源于真实的生物学重复（biological duplicates）或实验导致的PCR重复（experimental PCR duplicates）。而那些接近原点的重复序列更有可能是由测序仪导致的（optical duplicates）。这再次说明了HiSeq 4000产生了更多的duplication artefacts。
然后，我们研究了HiSeq 4000上的重复序列是否仅出现在相邻的纳米孔，或流动槽中同一局部区域中的某些纳米孔。虽然我们无法获得FASTQ坐标系与特定某个纳米孔的直接关联信息，但可以通过紧邻原点创建该区域的密度图来可视化HiSeq 4000流动槽。该图清楚地表明，在原点周围的多个孔中发现了重复序列，并且随着远离原点，这种趋势会减小。而HiSeq 2500数据中，正如预期，看不到纳米孔图案分布特征。
duplicates_patterned_flowcell-1
duplicates_unordered_flowcell-1

预防

其他研究者已经讨论过Patterned Flow Cell有产生更多重复序列的倾向性。在最近发表在 CRUK-CI Core Genomics 博客上的一篇文章中，James Hadfield 报告说，来自一个簇的文库分子可能会返回到周围的溶液中，然后作为相邻flow cell（应该是nanowell？）中第二个簇的种子。有人提出，可以通过增加上机文库浓度来最大程度地减少这些重新播种（re-seeding）事件，但是代价是会产生没有用的多克隆簇（指的应该是文库的experimental PCR duplicates？）。因此，需要在这两个相互竞争的问题之间取得平衡，使特异的有效的序列数量最大化。我们直接与Illumina讨论了这个问题，Illumina同意这一策略，并建议patterned flowcell测序仪可能需要逐个测序仪地进行校准，以确定最佳上机浓度。

Illumina测序产生的重复序列

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